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　　本发明针对野生冬虫夏草资源匮乏、供需矛盾突出的问题，提出采用高原素虫草真菌细脚拟青霉人工栽培方法。通过改良PDA培养基活化菌种、液体培养菌丝体、蚕蛹培养子实体，并严格控制温湿度、光照等条件，实现高原素虫草规模化生产，其活性成分含量优于野生虫草。

　　本发明属微生物技术领域，具体涉及一种富含活性物质的高原素虫草的菌种及其人 工栽培方法。

　　冬虫夏草是我国特有的名贵药材，与人参、鹿茸同列为重要的三大珍品，传统中医 学认为冬虫夏草具有补虚损、益精气、保肺、益肾等功效，近年医药研究发现还有镇静、 耐缺氧、抗炎、降压，改善心肌缺血和提高人体免疫等功能。长期以来，国内药用虫草采 自野生，由于冬虫夏草严格的寄生性和对生态环境要求的特殊性，天然产量很低，再加上 人为盲目采挖造成资源十分匮乏，并且严重破坏了高原地区的生态平衡。据文献报道，目 前天然冬虫夏草的市场供需比已达到1:100，供求矛盾异常突出，所以寻找冬虫夏草的天 然替代物日益受到人们的重视。本发明采用人工模拟野生环境，建立了P^m^^菌种活 化、液体培养法培养菌丝体和蚕蛹培养子实体的方法，得到了具有天然活性的高原素虫草。

　　高原素虫草的菌种P.fem^ M是一种自然条件下存在的虫生真菌。许多研究资料表明 它具有冬虫夏草的各种主要化学组分，甾醇类、糖醇类、生物碱、有机酸类和微量元素与 冬虫夏草十分相似，某些营养成分的含量还高出冬虫夏草。本发明将该菌种经改良PDA培 养基活化、改良营养肉汤培养基培养菌丝体后接种至蚕蛹上，培养过程中通过对温度、湿 度、光照、通风等严格的控制，营造出优于野生环境的营养条件和环境条件，最终使得虫 草菌丝分化、子实体形成，经干燥、粉碎后可做为增强免疫力和缓解体力疲劳等保健食品 的原料来源。

　　本发明的目的在于提供一种可以生产富含活性营养物质的高原素虫草的菌种，并提供 该菌种人工栽培生产虫草子实体的方法。

　　本发明提供的高原素虫草真菌，属子囊菌门，核菌纲，麦角菌目，麦角菌科，拟青 霉属，细脚拟青霉。菌株经中国科学院微生物研究所鉴定，菌落在PDA培养基上，25°C14 天直径约68mm，白色，丝绒状，边缘整齐，无色；菌落反面浅黄色。菌丝无色，多隔；产 孢结构为瓶梗，瓶梗基部膨大成球形，直径2.4-2.7pm，向上侧偏，收縮成瓶颈，直径约 1. 0pm，瓶颈直接对生于菌丝或生于1-2次分支的分生孢子梗上。分生孢子无色，表面光滑，

　　单个细胞，短柱状或椭圆形，3.8-7.5X2.0-2. 5pm。微生物保藏单位为中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2007年9月18日，保藏号为CGMCCNo.2232。 栽培方法

　　细脚拟青霉在改良的PDA固体培养基上接种菌种，进行菌种活化。然后，将活化的 菌种接入马铃薯营养肉汤培养基，进行菌丝体繁殖。在一广口栽培瓶中放入130-140g蚕 蛹，湿热灭菌并冷却后，接种入菌丝体，进行子实体培养。子实体培养初期在温度23-27 °C，湿度30_75%下避光进行，待5-15天后长出大量菌丝体后，培养条件改为温度17-19 °C，湿度75-100%，光照300-700Lx、氧气充分。得到的子实体呈淡黄色，富含天然虫草 所具有的各种营养成分。

　　这里，PDA培养基成分配比为马铃薯淀粉:葡萄糖:琼脂=1:4_6:3-4 。 所述马铃薯肉汤培养基的各组分的配比如下

　　营养肉汤 5-20g， 这里营养肉汤组分的重量配比为牛肉膏蛋白胨=3:4—3:6。

　　上述配方中，马铃薯汁由下述步骤获得将切成小块的马铃薯放入水中，马铃薯与水

　　的重量比为1:5—1:6，煮沸后温火保持25_40分钟，滤去渣，滤液即为马铃薯汁。

　　1. 固体培养基配制取没有发芽、变青的马铃薯，洗净去皮，称取200g，切成1 厘米左右见方的小块。将切好的马铃薯小块放入约1000-1200mL水中，煮沸后用温火保持 30分钟。结束后用纱布过滤，得到滤液为马铃薯汁，将滤液补足至1000mL。同时加入黄 糖10g，葡萄糖10g， PDA (马铃薯淀粉:葡萄糖:琼脂=4:20:15) 20g，搅拌均匀后分别倒 入试管，在12rC高温下灭菌60分钟，取出后倾斜放置，待冷却凝固后可用于转种，需大 量培养时配制可按比例调整用量。

　　2. 液体培养基配制取没有发芽、变青的马铃薯，洗净去皮，称取200g，切成1 厘米左右见方的小块。将切好的马铃薯小块放入约1000-1200mL水中，煮沸后用温火保持 30分钟。结束后用纱布过滤，得到滤液为马铃薯汁，将滤液补足至1000mL后分装成500m1/ 瓶(三角瓶为1000ml规格)。每瓶加入黄糖10g，营养肉汤(牛肉膏蛋白胨=3:5) 5g，还 可加入葡萄糖0-5g，大豆粉0-5g，搅拌均匀，塞上棉塞，在12rC高温下灭菌60分钟后 自然放冷、备用。需大量培养时配制可按比例调整用量。

　　3. 固体培养制种取尸.fewj^y菌种，无菌条件下接入固体斜面培养基，24-25。C避 光培养。菌丝覆盖表面约70%时，可接入液体培养基制种。

　　4. 从斜面培养基上取1小块(大小约3-5mmX3-5mm)菌丝放入装有液体培养基的三角 瓶内振荡培养。振荡次数90-95rpm，温度24-25C，培养约5-7天，待菌球长至适宜大小， 即可用于接种。

　　5. 蚕蛹准备在聚丙烯制成的广口栽培瓶里放入蚕蛹约130-140g，在121。C下灭菌 60分钟。

　　6. 接种灭菌后的蚕蛹在无菌接种室中冷却至24C以下，无菌条件下接种，每瓶接 入含菌丝的液体培养物3-5mL。

　　7. 将接种后的栽培瓶转移至温度24-25。C，湿度30-75%条件下避光培养，5-15天后 菌丝将长满并覆盖蚕蛹表面。

　　8. 将长满菌丝的栽培瓶转移至栽培室。栽培室控制温度为17-19°C，湿度75%以上， 光照约500Lx、氧气充分。约7-10天后长出子实体，这段期间栽培室要保持无菌状态，继 续培养约30-35天，完全长成呈淡黄色的高原素虫草。

　　9. 采收成熟的高原素虫草。将栽培瓶中的高原素虫草用机械力打碎后收集、干燥后 密封，用于进一步深加工。

　　注PDA培养基成分配比(马铃薯淀粉:葡萄糖:琼脂=4:20:15) 斜面培养基按照上述比例配好、搅拌均匀后分别倒入试管，将配制好的培养基在121 C蒸汽灭菌60分钟后，取出倾斜放置，待冷却凝固后转种，接种操作在超净台下进行， 接种后置于24-25C避光条件下培养。菌丝覆盖表面约70°/。时，将其转接至液体培养基进 行制种。

　　马铃薯汁 1000mL， 黄糖 20g， 营养肉汤* 10g， ^注营养肉汤成分配比(牛肉膏蛋白胨=3:5)。

　　在1000mL三角瓶中分别装500mL种子培养基，12rC蒸汽灭菌60分钟后放冷，接入 i^em/z;pM斜面菌(菌种保藏号CGMCCNo.2232)，在温度25和摇床转速95rpm的条件 下培养5天，菌液变稠，经检验无杂菌后即可使用；再称取135g蚕蛹装入特制广口瓶中， 灭菌后每瓶蚕蛹接入3mL种子菌液，确保接种操作在超净台下进行，以避免杂菌的侵入。 接入菌种后将瓶转移至25。C的暗室避光培养，5-15天后长出大量菌丝体，将瓶移入栽培 室，控制环境温度17_19°C，湿度保持75%以上，光照、氧气供应充分；移入7天后可见 子实体长出，30天后呈淡黄色的高原素虫草完全长成。

　　每瓶可收获鲜活的高原素虫草135-145g，干燥后每瓶干品重量约40-50g。经上海市 预防医学研究院检测，上述干燥、粉碎的高原素虫草中，每100g含腺苷、虫草酸、虫草 多糖分别为80mg、 1.8g、 660rag，明显优于野生虫草中的含量。 按照上述方法进行多批次栽培，结果稳定。

　　2、 一种如权利要求1所述的虫草真菌的人工栽培方法，其特征在于具体步骤如下 在改良的PDA固体培养基上接种菌种，进行菌种活化。然后，将活化的菌种接入马铃薯营 养肉汤培养基，进行菌丝体繁殖；在一广口栽培瓶中放入130-140g蚕蛹，湿热灭菌并冷 却后，接种入菌丝体，进行子实体培养，子实体培养初期在温度23-27。C，湿度30-75%下 避光进行，待5-15天长出大量菌丝体后，培养条件改为温度17-19°C，湿度75-100%，光 照300-700Lx，氧气充分；得到的子实体呈淡黄色，富含天然虫草所具有的各种营养成分。

　　3、 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述改良PDA固体培养基含有马铃薯淀 粉、葡萄糖、琼脂，各组分的重量配比如下马铃薯汁 1000mL，黄糖 5-20g，葡萄糖 5-20g，PDA 5-30g， 这里，PDA培养基成分配比为马铃薯淀粉:葡萄糖:琼脂=1: (4-6) : (3-4);所述马 铃薯汁由下述步骤获得将切成小块的马铃薯放入水中，马铃薯与水的重量比为1:5—1:6， 煮沸后温火保持25-40分钟，滤去渣，滤液即为马铃薯汁。

　　4、 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的马铃薯肉汤培养基的成分中含有 牛肉膏、蛋白胨、糖类，各组分的重量配比如下马铃薯汁 1000mL，黄糖 5-30g，营养肉汤 5-20g， 这里营养肉汤组分的重量配比为牛肉膏蛋白胨=3:4—3:6;所述马铃薯汁由下述步骤 获得将切成小块的马铃薯放入水中，马铃薯与水的重量比为1:5—1:6，煮沸后温火保持 25-40分钟，滤去渣，滤液即为马铃薯汁。

　　本发明属于微生物技术领域，具体为一种虫草真菌及其人工栽培方法。本发明公开的虫草真菌为高原素虫草真菌细脚拟青霉(Paecilomyces tenuipes(Peck)Samson＝P.tenuipes)，人工栽培方法包括菌种活化，液体培养法培养菌丝体和蚕蛹培养子实体。其主要步骤为采用蚕蛹作为人工栽培虫草的寄主，蚕蛹培养子实体分为两个阶段前期(0至5-15天)和后期(5-15天至采收)，前期应采用避光培养，后期要保证光照、氧气供应充分，环境湿度75％以上，同时后期与前期相比环境温度应有明显下降；本发明可满足人工虫草的规模化生产。

　　发明者巢正国, 江 钟, 马红岩 申请人:华富生物科技(上海)有限公司;复旦大学

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