本发明涉及药物栽培技术,公开了一种细虫草菌株及其人工培养方法。所述细虫草菌株为羽束梗孢(Paraisariadubia),保藏编号为CGMCCNo.20731。所述细虫草菌株的人工培养方法,包括以下步骤,将所述细虫草菌株经活化培养后,接种至固态培养基中进行仿生态培养生产细虫草子实体。本发明提供的细虫草菌株能够通过人工培养得到子实体,经培养获得的子实体不仅营养丰富,富含多糖、腺苷、不饱和脂肪酸EPA和亚油酸,而且营养成分的含量明显提高,适用于食品和保健品的开发。

　　2.一种细虫草菌株的人工培养方法,其特征在于,包括以下步骤,将所述细虫草菌株经活化培养后,接种至固态培养基中进行仿生态培养生产细虫草子实体,其中,所述细虫草菌株为羽束梗孢(Paraisariadubia),保藏编号为CGMCCNo.20731,

　　(1)将所述细虫草菌株接种至一级液体培养基中进行一级活化培养得到一代种子液,

　　(2)将步骤(1)得到的所述一代种子液接种至二级液体培养基进行二级活化培养得到二代种子液,

　　所述固态培养基含有大米、裂殖壶菌藻粉、麸皮和栽培营养液,所述大米、裂殖壶菌藻粉、麸皮和栽培营养液的质量比为0.36‑0.72:0.18‑0.36:0.06‑0.12:1,所述栽培营养液含有土壤浸提液、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉和ZnSO4·7H2O,所述栽培营养液中相对于1L所述土壤浸提液,所述葡萄糖的含量为10‑20g,所述蛋白胨的含量为5‑10g,所述酵母粉的含量为5‑10g,所述ZnSO4·7H2O的含量为0.01‑0.05g,所述仿生态培养中所述二代种子液的接种量占所述固态培养基的10‑20重量,,

　　所述仿生态培养包括暗发酵阶段和光照发酵阶段,所述暗发酵阶段的条件包括,温度为18‑27℃,相对湿度为60‑70,,时间为15‑30天,所述光照发酵阶段的过程包括,将经所述暗发酵阶段的培养物在温度为0‑10℃的条件下刺激8‑15h,再进行连续光照培养形成子实体原基,然后进行间歇光照培养直至子实体不再生长,所述连续光照培养的条件包括,温度为20‑27℃,光照强度为10‑100lux,相对空气湿度为50‑60,,所述间歇光照培养的条件包括,温度为20‑27℃,光照强度为10‑100lux,相对空气湿度为50‑60,,每天光照时间为10‑15h。

　　3.根据权利要求2所述的人工培养方法,其特征在于,所述裂殖壶菌藻粉的制备过程包括,将裂殖壶菌经发酵得到的发酵液进行固液分离后得到裂殖壶菌菌体,将所述裂殖壶菌菌体进行干燥、粉碎。

　　4.根据权利要求2所述的人工培养方法,其特征在于,所述土壤浸提液通过将土壤用水浸提后经固液分离得到。

　　5.根据权利要求4所述的人工培养方法,其特征在于,所述土壤与水的用量比为1:1‑2。

　　7.根据权利要求6所述的细虫草子实体,其特征在于,所述细虫草子实体的表面为棕褐色、内部为乳白色。

　　[0001]本发明涉及药物栽培技术,具体地,涉及一种细虫草菌株及其人工培养方法。

　　[0002]细虫草(Ophiocordycepsgracilis)属于子囊菌门(Ascomycota)、子囊菌纲(Ascomycetes)、粪壳菌亚纲(Sordariomycetidae)、肉座菌目(Hypocreales)、线虫草科(Ophiocordycepitaceae)、线虫草属(Ophiocordyceps),其无性型为羽束梗孢(Paraisariadubia)。细虫草是中国一种名贵的中草药,具有多种药理活性,常被用做冬虫夏草的代用药,治疗肿瘤、哮喘、高血脂、抑郁等,被收入新疆维吾尔自治区药品标准一书中。目前,细虫草的野生资源匮乏,过渡采挖的问题严重,使得其生境遭到严重破坏,资源严重锐减,亟需对其进行人工培养,以解决人们对细虫草资源的迫切需求。

　　[0003]国内外还鲜有关于细虫草子实体培养方面的报道,而成功栽培出子实体的虫草仅有几种,主要有,冬虫夏草、蛹虫草、蝉花、广东虫草,究其原因是虫草的子实体栽培技术还不够成熟,子实体的形成机制还不够清楚。细虫草作为一种极具潜力的药食两用的虫生真菌,寻找一种高产子实体的细虫草菌株并开发一种简便、有效、稳定的子实体栽培方法尤为重要,对虫草的开发利用也具有重要意义。

　　[0004]本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题,提供一种细虫草菌株及其人工培养方法,该细虫草菌株能够高产子实体,且子实体的营养成分丰富、培养效果稳定。

　　[0005]为了实现上述目的,本发明第一方面提供一种细虫草菌株,该细虫草菌株为羽束梗孢(Paraisariadubia),保藏编号为CGMCCNo.20731。

　　[0006]本发明第二方面提供一种细虫草菌株的人工培养方法,包括以下步骤,将所述细虫草菌株经活化培养后,接种至固态培养基中进行仿生态培养生产细虫草子实体,其中,所述细虫草菌株为羽束梗孢(Paraisaria dubia) ,保藏编号为CGMCC No.20731。

　　[0008] (1)将所述细虫草菌种接种至一级液体培养基中进行一级活化培养得到一代种子液,

　　[0009] (2)将步骤(1)得到的所述一代种子液接种至二级液体培养基进行二级活化培养得到二代种子液,

　　[0010] 优选地,所述仿生态培养中所述二代种子液的接种量占所述固态培养基的10‑20重量,。

　　[0014] 优选地,所述固态培养基含有大米、裂殖壶菌藻粉、麸皮和栽培营养液,

　　[0015] 优选地,所述大米、裂殖壶菌藻粉、麸皮和栽培营养液的质量比为0.36‑0.72:

　　[0016] 优选地,所述裂殖壶菌藻粉的制备过程包括,将裂殖壶菌经发酵得到的发酵液进行固液分离后得到裂殖壶菌菌体,将所述裂殖壶菌菌体进行干燥、粉碎。

　　[0017] 优选地,所述栽培营养液含有土壤浸提液、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉和ZnSO4 · 7H2O。

　　[0018] 优选地,所述栽培营养液中相对于1L所述土壤浸提液,所述葡萄糖的含量为10‑20g,所述蛋白胨的含量为5‑10g,所述酵母粉的含量为5‑10g,所述ZnSO4 · 7H2O的含量为

　　[0019] 优选地,所述土壤浸提液通过将土壤用水浸提后经固液分离得到。

　　[0022] 优选地,所述暗发酵阶段的条件包括,温度为20‑27℃,相对湿度为60‑70,,时间为15‑30天。

　　[0023] 优选地,所述光照发酵阶段的过程包括,将经所述暗发酵阶段的培养物在温度为0‑10℃的条件下刺激8‑15h,再进行连续光照培养形成子实体原基,然后进行间歇光照培养直至子实体不再生长。

　　[0024] 优选地,所述连续光照培养的条件包括,温度为20‑27℃,光照强度为10‑100lux,相对空气湿度为50‑60,。

　　[0025] 优选地,所述间歇光照培养的条件包括,温度为20‑27℃,光照强度为10‑100lux,相对空气湿度为50‑60,,每天光照时间为10‑15h。

　　[0028] 通过上述技术方案,本发明的有益效果为,本发明提供的细虫草菌株能够通过人工培养得到子实体,且本发明首次创新性地将富含不饱和脂肪酸的裂殖壶菌藻粉应用于细虫草的培养基中,不仅能够作为细虫草子实体生长的碳源之一,还能模拟细虫草寄主体内的脂质组分,使培养基成分与细虫草寄主成分更相似,结合培养基中利用土壤浸提液为基质配制的栽培营养液,能够进一步模拟野生虫草生长的土壤环境,以使得细虫草子实体生长得更粗壮,数量显著提升,经仿生态培养获得的子实体不仅营养丰富,富含多糖、腺苷、不饱和脂肪酸EPA和亚油酸,而且营养成分的含量明显提高,适用于食品和保健品。

　　[0029] 本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

　　[0031 ] 本发明提供的菌株为细虫草菌株无性型羽束梗孢(Paraisaria dubia) ,并于2020年09月23日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC) ,保藏编号为CGMCC No.20731 ,该保藏中心的地址为,北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮政编码,100101。

　　[0032] 图1是实施例1中细虫草菌株无性型羽束梗孢的仿生态培养过程图, (1)为接种初期,菌丝开始生长, (2)为羽束梗孢气生菌丝, (3)为子实体原基形成, (4)为细虫草子实体。

　　[0033] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值,这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说,各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间,以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围,这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

　　[0034] 第一方面,本发明提供了一种细虫草菌株,该细虫草菌株为羽束梗孢(Paraisaria dubia)于2020年09月23日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址,北京市朝阳区北辰西路1号院3号) ,保藏编号为CGMCC No.20731。

　　[0035] 本发明提供的细虫草菌株是将从细虫草中分离出的羽束梗孢(编号HL‑119A)作为出发菌株,经诱变育种仪诱导获得的,其中,诱导的过程包括,

　　[0036] 将从细虫草中分离出的羽束梗孢出发菌株进行培养后,制得羽束梗孢孢子悬液(1×106个/mL) ,将10μL羽束梗孢孢子悬液均匀涂布于灭菌载片表面,于常压室温等离子体(天木生物科技有限公司,型号,ARTP‑M)操作室内进行诱变,诱变后的载片放入盛有1mL无菌溶液的2mL规格的EP管中震荡洗脱,然后涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上,挑选生长旺盛的菌株进行子实体培养,以子实体产量为指标筛选高产子实体的菌株,获得羽束梗孢诱变菌株,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.20731。

　　[0037] 本发明的发明人分离筛选出的上述细虫草菌株,不仅能够经过人工培养获得子实体,实现细虫草的人工栽培,减少或避免对野生细虫草的采挖,而且经本发明提供的培养方法获得的子实体还富含二十碳五烯酸(EPA) 、亚油酸等多不饱和脂肪酸,进一步提升细虫草子实体的开发利用价值。

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　　[0038] 本发明提供的羽束梗孢属于细虫草无性型,经过培养能够产生大量细虫草子实体,本发明对培养方法没有特别的限制,只要通过该培养方法可以使所述羽束梗孢进行大量增殖即可。

　　[0039] 本发明第二方面提供一种细虫草菌株的人工培养方法,包括以下步骤,将所述细虫草菌株经活化培养后,接种至固态培养基中进行仿生态培养生产细虫草子实体,其中,所述细虫草菌株为羽束梗孢(Paraisaria dubia) ,保藏编号为CGMCC No.20731。

　　[0040] 根据本发明,为了进一步提升本发明所提供的羽束梗孢子实体的产量和培养过程的稳定性,优选地,所述活化培养的过程包括,

　　[0041 ] (1)将所述细虫草菌株接种至一级液体培养基中进行一级活化培养得到一代种子液,

　　[0042] (2)将步骤(1)得到的所述一代种子液接种至二级液体培养基进行二级活化培养得到二代种子液。

　　[0043] 发明人发现,在该优选的具体实施方式下,有利于提高细虫草菌株羽束梗孢的生长活性,进而提高子实体的产量。

　　[0044] 根据本发明,对所述仿生态培养中细虫草菌株的接种量没有特别的限定,只要使得细虫草菌株能够在固态培养基中生长增殖即可。优选地,所述仿生态培养中所述二代种子液的接种量占所述固态培养基的10‑20重量,,以提高细虫草菌株生长的稳定性和子实体的产量。

　　[0045] 根据本发明,所述一级液体培养基和所述二级液体培养基分别含有碳源I、氮源I、镁盐、钾盐等营养组分。具体地,碳源I可以为葡萄糖、蔗糖、果糖等常规的碳源物质,优选为葡萄糖,氮源I可以为蛋白胨、酵母膏、酵母粉等常规的氮源物质,优选为蛋白胨,镁盐可以为硫酸镁、氯化镁、硝酸镁等常规的镁盐物质,优选为硫酸镁,钾盐可以为硫酸钾、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等常规的钾盐物质,优选为磷酸二氢钾。本发明中,所述一级液体培养基和所述二级液体培养基的组分可以相同,也可以不同,在所述一级液体培养基和所述二级液体培养基的组分相同的情况下,两者中各组分的含量可以相同,也可以不同。

　　[0046] 优选情况下,所述一级液体培养基和所述二级液体培养基分别独立地含有,葡萄糖10‑30g/L,蛋白胨5‑15g/L,MgSO4 · 7H2O 0.5‑2g/L,KH2PO4 1‑3g/L。发明人发现,在该优选的具体实施方式下,有利于提升对细虫草菌株的活化效果,进而能够促进其在固态培养基中的生长活性。

　　[0047] 根据本发明,优选地,所述一级活化培养的条件包括,温度为18‑27℃,具体可以为18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、27℃,或者上述两个值之间的任意值,转速为120‑150rpm,具体可以为120rpm、130rpm、140rpm、150rpm,或者上述两个值之间的任意值,时间为10‑15天,具体可以为10天、11天、12天、13天、14天、15天,或者上述两个值之间的任意值。发明人发现,在该优选的具体实施方式下,能够优化细虫草菌株的活化效果。

　　[0048] 根据本发明,优选地,所述二级活化培养的条件包括,温度为18‑27℃,具体可以为18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、27℃,或者上述两个值之间的任意值,转速为120‑150rpm,具体可以为120rpm、130rpm、140rpm、150rpm,或者上述两个值之间的任意值,时间为7‑10天,具体可以为7天、8天、9天、10天,或者上述两个值之间的任意值。发明人发现,在该优选的具体实施方式下,能够优化细虫草菌株的活化效果。

　　[0049] 根据本发明,优选地,所述固态培养基含有大米、裂殖壶菌藻粉、麸皮和栽培营养液。发明人发现,在该优选的具体实施方式下,不仅能够将裂殖壶菌藻粉作为细虫草子实体生长的碳源之一,还能利用裂殖壶菌藻粉含有油脂的特性,模拟细虫草寄主体内的脂质组分,使固态培养基成分与细虫草寄主成分更相似,有利于提高子实体中不饱和脂肪酸和多糖、腺苷等活性成分的含量。

　　[0050] 根据本发明,优选地,所述大米、裂殖壶菌藻粉、麸皮和栽培营养液的质量比为

　　0.36‑0.72:0. 18‑0.36:0.06‑0. 12: 1。发明人发现,在该优选的具体实施方式下,能够将裂殖壶菌藻粉与大米、麸皮等其它成分更好地配合,使得固态培养基更加适于细虫草子实体的生长。

　　[0051 ] 根据本发明,优选地,所述裂殖壶菌藻粉的制备过程包括,将裂殖壶菌经发酵得到的发酵液进行固液分离后得到裂殖壶菌菌体,将所述裂殖壶菌菌体进行干燥、粉碎。本发明中,裂殖壶菌的发酵液通过本领域已公开的菌株和发酵方法获得,发酵液的固液分离可以采用本领域常规的分离方式,例如过滤、静置分层或者离心等。

　　[0052] 根据本发明,所述栽培营养液含有土壤浸提液、碳源II、氮源II和锌盐,具体地,采

　　用土壤浸提液为溶剂,将碳源II、氮源II、锌盐溶解在土壤浸提液中配制得到。本发明中,碳源II可以为葡萄糖、蔗糖、果糖等常规的碳源物质,优选为葡萄糖,氮源II可以为蛋白胨、酵母膏、酵母粉等常规的氮源物质,优选为蛋白胨和/或酵母粉,锌盐可以为硫酸锌、氯化锌、硝酸锌等常规的锌盐物质,优选为硫酸锌。

　　[0053] 示例性地,所述栽培营养液含有土壤浸提液、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉和ZnSO4 ·7H2O。发明人发现,在该优选的具体实施方式下,利用土壤浸提液为基质配制的栽培营养液,实现固态培养基能够进一步模拟野生虫草生长的土壤环境,以使得细虫草子实体生长得更粗壮,数量显著提升。

　　[0054] 根据本发明,优选地,所述栽培营养液中相对于1L所述土壤浸提液,所述葡萄糖的含量为10‑20g,所述蛋白胨的含量为5‑10g,酵母粉的含量为5‑10g,ZnSO4 · 7H2O的含量为

　　0.01‑0.05g。发明人发现,在该优选的具体实施方式下,有利于提供更加适于细虫草菌株子实体生长的营养组分。

　　[0055] 根据本发明,优选地,所述土壤浸提液通过将土壤用水浸提后经固液分离得到。更优选地,所述土壤与水的用量比为1 : 1‑2。本发明中,土壤浸提液的土壤为健康的腐殖质土壤,土壤用水浸提后的固液分离可以采用本领域常规的分离方式,例如过滤、静置分层或者离心等。

　　[0056] 根据本发明,优选地,所述仿生态培养包括暗发酵阶段和光照发酵阶段。本发明中,所述暗发酵阶段在黑暗状态中进行,光照发酵阶段在连续光照和/或间歇性光照条件下进行。发明人发现,在该优选的具体实施方式下,有利于促进子实体的生长,提高子实体产量。

　　[0057] 根据本发明,优选地,所述暗发酵阶段的条件包括,温度为20‑27℃,具体可以为20℃、22℃、24℃、26℃、27℃,或者上述两个值之间的任意值,相对湿度为60‑70,,具体可以为60,、62,、64,、66,、68,、70,,或者上述两个值之间的任意值,时间为15‑30天,具体可以为15天、20天、25天、30天,或者上述两个值之间的任意值。

　　[0058] 根据本发明,优选地,所述光照发酵阶段的过程包括,将经所述暗发酵阶段的培养物在温度为0‑10℃的条件下刺激8‑15h,再进行连续光照培养形成子实体原基,然后进行间歇光照培养直至子实体不再生长。

　　[0059] 根据本发明,优选地,所述连续光照培养的条件包括,温度为20‑27℃,具体可以为20℃、22℃、24℃、26℃、27℃,或者上述两个值之间的任意值,光照强度为10‑100lux,具体可以为10lux、30lux、50lux、70lux、100lux,或者上述两个值之间的任意值,相对空气湿度为50‑60,,具体可以为50,、52,、54,、56,、58,、60,,或者上述两个值之间的任意值。

　　[0060] 根据本发明,优选地,所述间歇光照培养的条件包括,温度为20‑27℃,具体可以为20℃、22℃、24℃、26℃、27℃,或者上述两个值之间的任意值,光照强度为10‑100lux,具体可以为10lux、30lux、50lux、70lux、100lux,或者上述两个值之间的任意值,相对空气湿度为50‑60,,具体可以为50,、52,、54,、56,、58,、60,,或者上述两个值之间的任意值,每天光照时间为10‑15h,具体可以为10h、11h、12h、13h、14h、15h,或者上述两个值之间的任意值。

　　[0061 ] 本发明第三方面提供上述的人工培养方法得到的细虫草子实体。

　　[0062] 根据本发明,优选地,所述细虫草子实体的表面为棕褐色、内部为乳白色。

　　[0063] 根据本发明一种特别优选的实施方式,细虫草菌株的人工培养方法,包括以下步骤,

　　[0066] (3)将步骤(2)得到的所述二代种子液接种至固态培养基,固态培养基含有质量比为0.36‑0.72:0. 18‑0.36:0.06‑0. 12: 1的大米、裂殖壶菌藻粉、麸皮和栽培营养液,栽培营养液含有土壤浸提液、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉和ZnSO4 · 7H2O,在温度为20‑27℃,相对湿度为60‑70,的条件下进行暗发酵阶段15‑30天,将经暗发酵阶段的培养物在温度为0‑10℃的条件下刺激8‑15h,再在温度为20‑27℃,光照强度为10‑100lux,相对空气湿度为50‑60,的条件下进行连续光照培养形成子实体原基,然后在温度为20‑27℃,光照强度为10‑100lux,相对空气湿度为50‑60,的条件下进行间歇光照培养(每天光照时间为10‑15h)直至子实体不再生长,

　　[0068] 本发明首次创新性地将富含不饱和脂肪酸的裂殖壶菌藻粉应用于细虫草的培养基中,不仅能够作为细虫草子实体生长的碳源之一,还能模拟细虫草寄主体内的脂质组分,使培养基成分与细虫草寄主成分更相似,结合培养基中利用土壤浸提液为基质配制的栽培营养液,能够进一步模拟野生虫草生长的土壤环境,以使得细虫草子实体生长得更粗壮,数量显著提升,经培养获得子实体不仅营养丰富,富含多糖、腺苷、不饱和脂肪酸EPA和亚油酸,而且营养成分的含量明显提高,适用于食品和保健品。